我试着帮你分析一下吧,若不对,请见谅.
感觉你还是PCR设置有问题,1调整一下温度,2调整一下循环数和循环时间.因为你毕竟第二次可以P出来,所以试剂、原料,都应该是没问题的.
建议你参考一下,与你做同一个试验或类似试验的相关文章,看他们的PCR设置.
这个,有时候,确实需要摸索的,呵呵