英语翻译
嗜热腾冲菌脂肪酶是来源于腾冲菌的一种耐高温脂肪酶,这类来源于极端嗜热环境嗜热菌的酶类具有极好的高温反应活性和稳定性,在能源、化工、食品和医药等行业展现出越来越广阔的应用潜力.本课题对腾冲菌耐热性的脂肪酶基因进行定点突变.
参考腾冲菌的脂肪酶序列,设计两对脂肪酶基因表达片断的PCR引物,以构建好的腾冲菌基因质粒为模板进行定点突变,对281位（脯氨酸变为天冬氨酸）、316位（亮氨酸变为组氨酸）进行定点突变.将成功突变后的质粒热激转入大肠杆菌表达宿主DH10B中,当重组菌OD600至0.0.6时,用终浓度1 mmol/L IPTG进行诱导表达,收集菌体、洗涤、超声波破壁,得到粗酶液.将粗酶经热处理,Ni-his NTA(Novagen)进行纯化,对脂肪酶进行跑蛋白胶验证,并测定该重组酶的酶学性质.
此酶在12% SDS-PAGE凝胶电泳显示相对分子量为44kDa.对硝基苯十二酯(pNP-C12)为底物在80℃,pH为6.3的条件下,重组脂肪酶活达到最大,为376.49U/mL,在80℃保温2h残余酶活大于75%.其米氏常数Km值为1.229 mol/L.该酶在终浓度5 mmol/LNi2+、Mg2+、Ba2+、Mn2+、Co2+、Ca2+、和终浓度0.25% Tween 20作用下对酶活没较大影响.然而,在终浓度5 mmol/LZn2+、Cu2+、和终浓度0.005%的SDS作用下相对酶活的下降至32.97%、54.97%和54.97%,且在终浓度5 mmol/LAl3+作用下相对酶活的明显降低,降至9.76%.