DNA连接酶：主要是连接DNA片段之间的磷酸二酯键,起连接作用,在基因工程中起作用.
DNA聚合酶：主要是连接DNA片段与单个脱氧核苷酸之间的磷酸二酯键,在DNA复制中起做用.
DNA聚合酶只能将单个核苷酸加到已有的核酸片段的3′末端的羟基上,形成磷酸二酯键;而DNA连接酶是在两个DNA片段之间形成磷酸二酯键,不是在单个核苷酸与DNA片段之间形成磷酸二酯键.
DNA聚合酶是以一条DNA链为模板,将单个核苷酸通过磷酸二酯键形成一条与模板链互补的DNA链;而DNA连接酶是将DNA双链上的两个缺口同时连接起来.因此DNA连接酶不需要模板.