培养基经高压灭菌后,用经过灭菌的工具（如接种针和吸管等）在无菌条件下接种含菌材料（如样品、菌苔或菌悬液等）于培养基上,这个过程叫做无菌接种操作.在实验室检验中的各种接种必须是无菌操作.
实验台面不论是什么材料,一律要求光滑、水平.光滑是便于用消毒剂擦洗；水平是倒琼脂培养基时利于培养皿内平板的厚度保持一致.在实验台上方,空气流动应缓慢,杂菌应尽量减少,其周围杂菌也应越少越好.为此,必须清扫室内,关闭实验室的门窗,并用消毒剂进行空气消毒处理,尽可能地减少杂菌的数量.
空气中的杂菌在气流小的情况下,随着灰尘落下,所以接种时,打开培养皿的时间应尽量短.用于接种的器具必须经干热或火焰等灭菌.接种环的火焰灭菌方法：通常接种环在火焰上充分烧红（接种柄,一边转动一边慢慢地来回通过火焰三次）,冷却,先接触一下培养基,待接种环冷却到室温后,方可用它来挑取含菌材料或菌体,迅速地接种到新的培养基上.（图3－4）然后,将接种环从柄部至环端逐渐通过火焰灭菌,复原.不要直接烧环,以免残留在接种环上的菌体爆溅而污染空间.平板接种时,通常把平板的面倾斜,把培养皿的盖打开一小部分进行接种.在向培养皿内倒培养基或接种时,试管口或瓶壁外面不要接触底皿边,试管或瓶口应倾斜一下在火焰上通过.