2,上游引物设计：选取正向5’-3’的基因序列约23bp左右,copy下来；在这段序列的5’端加上你的上游酶切位点（一般6bp）,再在之前加入两个任意碱基作为保护碱基；序列为：保护碱基（2bp）+上游酶切位点（6bp）+基因起始序列5’-3’,引物碱基总长约28-30bp.
3,下游引物设计：将序列反相互补,得到互补链序列,选取5’-3’的基因序列约20bp左右,同样在5’端加上下游酶切位点和保护碱基；一般情况下还需要在酶切位点和基因之间加上stop codon.序列为：保护碱基（2bp）+下游酶切位点（6bp）+stop codon(3bp)+基因互补序列起始序列5’-3’,引物碱基总长约28-30bp
4,检查：（1）引物长度；（2）上游酶切位点是否移码,如果移码,则应增加1-2个碱基恢复读码框；（3）如果下游没有设计终止密码子,也应检测是否移码,PCR能否顺利终止,不行则休正；（4）退火温度,一对引物的退火温度不能相差太大,否则应调节碱基使之满足要求.