丙酮酸进入线粒体的基质中,两分子丙酮酸和6个水分子中的氢全部脱下,共脱下20个[H],丙酮被氧化分解成二氧化碳；在此过程释放少量的能量,其中一部分用于合成ATP,产生少量的能量.这一阶段也不需要氧的参与,是在线粒体基质中进行的.反应式：2C3H4O3(丙酮酸)+6H2O酶→20[H]+6CO2+少量能量 (2ATP)
此外,在第2阶段中,乙酰辅酶A（乙酰CoA）的二碳乙酰基,通过三羧酸循环转变为CO2和氢原子