首先,要确定引物设计成功了啊.
其次,确定试剂都是好的.
再次,确定模板DNA是没有降解太厉害.
还有就是PCR房间温度要控制在室温状态.
像这种夏天要要保持在25--30度室温.
以上都确定了之后,我建议你设计一下touchdown程序（每个循环降0.5度,这个具体程序你去查查,既可以减少非特异扩增,而且不用摸退火温度条件）.
你还可以摸摸温度梯度咯.这个程序就是那个Gradient选项（前提你的PCR仪是可以做温度梯度的PCR）.
如果所有的温度梯度都扩增不出来,我就倾向于是你的引物设计不好了.
一般退火温度越高,越不容易出现非特异,它对引物和模板的匹配要求很高.如果扩增不出来,可以考虑降低退火温度,这样虽然容易出现非特异片段,但是目的片段也相应容易扩增出来.