A、将微生物的接种工具，如接种环、接种针或其他的金属用具，直接在酒精灯火焰的充分燃烧层灼烧，可以迅速彻底地灭菌，故A正确；
B、接种环必须冷却后，才可以伸入菌液中蘸取一环液，否则会烧伤或烧死微生物，故B正确；
C、蘸取菌液和划线要在火焰旁进行，防止空气中的杂菌，故C正确；
D、划线时要避免最后一区的划线与第一区线连． 因为最后一区是细菌最稀少的，而第一区是细菌最致密的，如果连在一起则有可能影响单个菌落的分离效果，故D错误．
故选：D．