A、转基因马铃薯和普通马铃薯不存在生殖隔离，仍然属于同一物种，A错误；
B、原来马铃薯是没有人奶蛋白基因的，基因频率为零，人为种植了之后，肯定要不断选择，于是基因频率会增大的，B错误；
C、马铃薯的叶肉细胞可以作为受体细胞，导入目的基因后进行植物组织培养，C错误；
D、由于同种限制酶识别DNA分子相同的特定核苷酸序列，所以用同种限制酶，分别处理质粒和含目的基因的DNA，可产生相同的黏性末端而形成重组DNA分子，D正确．
故选：D．