退火温度一般是比你设计引物时的tm值低5度.不过这是要摸索的,用温度梯度PCR.（顺便说一下,如果你不想花时间摸索温度,建议就用60度.这个温度是我原来做实验时的万能温度.尤其对较短片段PCR适用）延长时间是看PCR产物...