一切准备就绪后,在接种环（或接种针）在培养基上划三道线,之后将接种环（或接种针）在火焰灼烧,以便杀死残留的菌种,第二次划线从上一次的末端向另一个方向再画三下,（因为末端的菌种比始端的菌种少）再用火焰灼烧一下.以此类推菌种便越来越少,便有希望得到有单个细胞繁殖而来的菌落.