A、将抗原注入小鼠体内，刺激小鼠体内产生体液免疫，从而获得能产生抗体的B淋巴细胞，故A正确；
B、用胰蛋白酶或胶原蛋白酶处理B淋巴细胞，骨髓瘤细胞能在体外培养条件下无限增殖，所以不需要用胰蛋白酶处理，故B错误；
C、淋巴细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合需要灭活的病毒或聚乙二醇或物理因素来诱导，故C正确；
D、由于第一次筛选获得的杂交瘤细胞产生多种抗体，所以需进一步筛选以获得能产生所需抗体的杂交瘤细胞，再进行克隆化培养后提取单克隆抗体，故D正确．
故选：B．