Tm 值 有 多 种 计 算 方 法 .我 们 使 用 近 邻 法 ( P N A S 8 3 ,3 7 4 6- 5 0 )来计算.用这种方法计算前,也有多种方法来估测.如果是15个碱基以下,那么有一种好的方法来估算,对于A和T,可以乘以2癈,对于C和G,可以乘以4癈然后相加,这叫做Wallace法则.
Tm= 2℃ (A + T) + 4℃ (G + C)
另一种方法来估计长链中GC含量
Tm = 81.5 + 0.41(%GC) - 500/L + 16.6 log[M]
(L:寡核苷酸的长度；M:1价阳离子的浓度)
但这些方法不能消除碱基堆积的影响,结果并不准确,所以近邻法被广泛的应用.但是,对于在60-70 bp或15bp以下的寡核苷酸的测定,近邻法还是有缺点.
Bioneer使用的近邻法具有新的特点.它考虑到在退火过程中不同的碱基序列的影响,并且通过热力学来测定,可以更有效的测定Tm值.比如5' -GC-3' 和5' -CG-3'的序列用热力学方法测定结果是不同的.计算方法见截图：
依靠热力学方法,焓和熵通过两个碱基来确定.[salt]是指一价阳离子的浓度,[Oligo]是指反应过程中的寡核苷酸浓度.R是指气体常数(1.987 cal•K-1mol-1).Bioneer用近邻法计算Tm值时,使用的是50 mM的盐浓度和1 nM的寡核苷酸的浓度.
Bioneer会给每一个用户提供Tm值,但这只是估计值,我们不能保证精确性,因此这个值仅供用户参考.
如果没有扩增出产物,你可以把退火温度降到Tm值以下4～5癈.如果有许多非特异性的产物,你需要改变实验条件如提高退火温度以得到正确的产物.
