∵D、E、F分别是△ABC三边的中点，
∴EF∥BC，DF∥AC，DE∥AB，EF=

1

2

BC，
∴∠EFD=∠FDB=∠C，∠FED=∠EDC=∠B，
∴△DEF∽△ABC，
∴S_△DEF：S_△ABC=EF²：BC²=1：4，
∴S_△DEF=

1

4

S_△ABC=

1

4

S．
故选D．