因为内切酶的酶活性单位定义是在50ul反应体系中,最适温度反应1小时能够讲1ugDNA完全酶切的酶量.所以,一般在酶切体系里,DNA的量是可以加到非常大的.因为考虑到后期的纯化后DNA的损失问题,所以推荐酶切体系中的DNA尽量多加一些.这样你纯化回收后的DNA剩下的就比较多,有利于后期的连接以及筛选.具体的话,我经常做的就是50ul体系中除了buffer和酶以外,其他的成份全部都是载体或者插入片段的溶液.当然,你得保证你的DNA浓度约可以达到50ng/ul左右的浓度.最后,做连接的时候一定要注意插入片段和载体的摩尔比,理想状态下应该是3-10比1.要是知道了载体和插入片段的浓度怎么计算摩尔比？希望详细点，最好可以举个例子。还有就是怎么根据跑的电泳的结果来判断载体和插入DNA的浓度？非常感谢，因为第一次做，什么都不懂，教授逼得还比较紧，麻烦您了！！简单来说，分子量越大，同样质量浓度的DNA摩尔浓度越小，因为都是DNA分子，所以这只是一个非常简单的比例换算问题了。举个例子来说，假设载体与插入片段浓度一致，载体是10kb，插入片段是1kb，要达到载体比插入片段的摩尔比为10比1的时候，那么你加入的载体和插入片段体积就应该是1比1。另外关于DNA浓度，你可以看下你的marker说明上是否有标明条带的DNA浓度，如果有，那么根据电泳的条带亮度与marker亮度对比去估计DNA浓度，如果没有的话，用分光光度计去测A260nm的OD值。如果测量OD值的话，你只要得到插入片段和载体的OD值比例关系就行了，因为具体计算的时候考虑的也只是比例而不是实际浓度。当然，你至少得保证，你的载体片段和插入片段进行电泳的时候，能够看到清晰的条带。