overlap
一、用这对引物
A1-F：gggggcccccaggctgacttaccagtccgccacctttg
A2- R：gatgacctcctcgcccttgctcaccatggtgcgcgcattggggcgccgggaag
扩增出片段A,产物长2540bp左右[color=Red]
已割胶回收,即片段A
二、用这对引物
B1- F：tcttcccggcgccccaatgcgcgcaccatggtgagcaagggcgaggaggtcatc
B2- R：cggatatccgatacattgatgagtttggacaaaccac
扩增出B片段,产物长1680bp
已割胶回收,即片段B
三、把一、二步中得到的PCR产物A、B通过overlap PCR连接起来,产物长4200bp左右
使用引物：
A1-F：gggggcccccaggctgacttaccagtccgccacctttg
B2- R：cggatatccgatacattgatgagtttggacaaaccac
就在这一步问题出现了,就是这步做了N多次,就是PCR不出目标条带,（每一次pcr产物都会出两个杂带很亮大约一个1100bp,一个1800bp,始终无目标带）
本人使用primestar酶 采用温度梯度(50度至65度)、模板1:1浓度梯度（20ng至200ng）、同时也采用了两步法（68度5分钟或者72度5分钟退火延伸）.也使用过LATAQ酶 PfuUltra IIFusion HS DNA Polymerase 酶.都没扩增出目标条带.
也采用过体系中仅仅不加引物直接跑PCR20个循环,在加入引物在跑30个循环（也这样做过,取该体系中混合液2微升做模板,在重新做一次该PCR）结果还是没有目标条带.
以上PCR全是延伸5分钟,终延伸10分钟.具体的PCR都是按照酶的说明书操作.
本人可以说在实验过程中可以完全不用考虑因实验操作导致失败---这点可以肯定无误!