我在做overlap PCR,两个片段一条736bp,一条255bp,20个重叠碱基,四个引物的TM值都是59度,两条都P出来了
现在加入两端的引物,就是扩不出来1000的条带,这20重叠有13个是CG对,我不知道是不是退火温度的原因,54°了都,总之就是两条链不连,
人气:132 ℃ 时间:2020-06-03 08:05:04
解答
试试把退火时间延长一些,看能不能把两条链连上.一般就是照着引物的Tm值做就可以的.退火时间是30S,应该足够了,对于退火温度能给个建议吗?我现在不加两端引物,先做Pool,看看能不能连,谢谢你的建议!退火时间确实不是一个很关键的因素。你两条链的量怎么样?PCR的时候最好两条模板链的加入量差不多,这样容易连上。退火温度,我也试着往下降过,不过没有用,最后也不知道怎么就做出来了。。。。。。两条链含量相近,55°退火30s,25个循环,现在Pool做出来了,不是很亮,加两端引物扩增后就很亮了,谢谢你的帮助!
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