你打算用载体上的启动子是吧,设计引物的时候,把目标序列cDNA全长都扩增进去就行了.上游引物肯定要有基因起始密码子的.
不过,你的问题中,“5'端增加的酶切位点中”这句话有问题.5'端是需要增加酶切位点,但酶切位点都在基因序列区上游,上游引物是“酶切位点”然后紧接着“ATG……”.