A、DNA连接酶用于基因工程中，将两个末端连接起来，A错误；
B、DNA酶是水解DNA分子的酶，B错误；
C、DNA解旋酶用于DNA分子复制和转录时，将DNA分子双螺旋结构解开并使氢键断裂，C错误；
D、在DNA分子复制时，DNA聚合酶将单个的脱氧核苷酸连接成DNA分子，形成新的DNA分子，D正确；
故选：D．