A、反转录酶能催化反转录过程，但其作用部位不是磷酸二酯键，A错误；
B、RNA聚合酶的作用是催化转录形成RNA，能形成RNA上的磷酸二酯键，而限制酶是作用于DNA上的磷酸二酯键，B错误；
C、DNA连接酶连接的是两个DNA片段之间的磷酸二酯键，作用于与限制性核酸内切酶相对的部位，C正确；
D、DNA解旋酶能解开双链DNA，破坏的是碱基对之间的氢键，D错误．
故选：C．