DNA链中核苷酸以3’,5’-磷酸二酯键连接,合成DNA所用的底物是 2’-脱氧核苷三磷酸.2’,3’ddNTP与普通dNTP不同,它们在脱氧核糖的3’位置缺少一个羟基.在DNA聚合酶作用下通过三磷酸基团掺入到延伸的DNA链中,但由于没有3’羟基,不能同后续的dNTP形成磷酸二酯键,因此,正在延伸的DNA链不能继续延伸.在DNA合成反应混合物的4种普通dNTP中加入少量的一种ddNTP,链延伸将与偶然发生但却十分特异的链终止竞争,产物是一系列的核苷酸链,其长度取决于引物末端到出现过早链终止位置间的距离.在4组独立酶反应中分别采用4种不同的ddNTP,结果将产生4组寡核苷酸,它们将分别终止于模板链的A、C、G或T位置