1.首先这应该是个融合表达载体.应该考虑后面的读码框问题.就是应该适当在后面的酶切位点前加入0-2个碱基.使得你的目的基因和egfp在同一读码框内.
2.KOZAK序列在真核细胞中表达有作用,这就看你后期的实验目的了.不过不加的话应该只是效果没有加了好,而不是没有效果.下游当然不用加.
3.NEB公司的网站上有特定酶的保护碱基图表.他们应该都是进行过研讨的,所以建议您参考这个.
4.克隆目的基因当然要保证从ATG开始.到终止码结束.这样叫一个完整的CDS区,表达一个完整的功能蛋白.不可以小于这个范围,但是多出来也许可以吧.就是从两侧的UTR区开始设计.但是我不敢保证啊.所以我建议您先在UTR区设计引物,扩出来长片段后再扩增您的目的片段.这样会容易点.
P.S.保护碱基的作用是可以使PCR产物两端的酶切位点被识别,从而可以直接酶切PCR产物使其产生粘性末端,以便进行后续的克隆.这和PCR能否扩增出来没有任何关系.