引物的3’端要与模板严格配对,而5’端碱基没有严格的限制,只要与模板DNA 结合的部分足够长,其5’端碱基可不与模板DNA配对而呈游离状态,这样,我们可以在引物的 5 末端加上酶切位点,因此退火温度依然取决于之前引物的退火温度.